一、目的与要求：

1、明确测定各类色素的原理与方法。

2、通过此实验掌握纸层析定性法与提纯色素的定量法。

二、原理：

    聚酰胺是具有二极性的化合物，水溶性酸性染料在酸性条件下被聚酰胺吸附，而在碱性条件下解吸附，再用纸色谱法或薄层色谱法进行分离后与标准比较定性、定量。

    三、试剂：

    1、聚酰胺粉(尼龙6)

2、硫酸1：1 0

3、甲醇—甲酸溶液：6：4

4、甲醇

5、20％柠檬酸溶液

6、10％钨酸钠溶液

    7、石油醚：沸程60-90℃

    8、海砂：先用l：10盐酸煮沸15min，用水洗中性，再用5％氢氧化钠溶液煮沸15min，再于105℃干燥，贮于具玻璃塞的瓶中，备用。

    9、乙醇-氨溶液：取1毫升氨水，加70％乙醇至100毫升。

10、50％ 乙醇溶液

11、硅胶G。

12、PH6的水：用20％柠檬酸调节至PH 6。

13、盐酸: 1：10

14、5％氢氧钠溶液

15、碎瓷片：处理方法同海砂

16、展开剂

    a、正丁醇-无水乙醇-1％氨水(6：2：3)：供纸色谱用。

    b、正丁醇-吡啶-1％氨水(6：3：4)：供纸色谱用。

    c、甲乙酮-丙酮-水(7：3：3)：供纸色谱用。

    d、甲醇-乙二胺-氨水(10：3：2)：供薄层色谱用。

    e、甲醇-氨水-乙醇(5：1：10)：供薄层色谱用。

    f、2.5％柠檬酸钠-氨水-乙醇(8：1：2)供薄层色谱用。

    17、色素标准溶液{以下商品作为标准以100％计。

    胭脂红：纯度60％；苋菜红：纯度60％；柠檬黄：纯度60%；靛蓝：纯度40％；日落黄：纯度60％，亮蓝；纯度60％。

    精密称取上述色素各0.100克，用PH6的水溶解，移入100毫升容量瓶中并稀释至刻度。此溶液每毫升相当于1毫克商品色素。靛蓝溶液需在暗处保存。

    18、色素标准使用液：用时吸取色素标准溶液各5.0毫升，分别置于50毫升容量瓶中，加PH6的水稀释至刻度。此溶液每毫升相当于0.1毫克商品色素。

四、仪器：

1、分光光度计

2、微量注射器或色素吸管

3、展开槽，25 X 6 x 4cm

4、层析缸

5、滤纸、中速滤纸，纸色谱用

6、薄层板：5 X 20em

    7、电吹风机

    8、水泵

    五、操作方法：

    1、样品处理

    A、果味水、果子露、汽水：吸取50.0毫升样品于100毫升烧杯中，汽水需加热驱除二氧化碳。

    B、配制酒：吸取100.0毫升样品于烧杯中，加碎瓷片数块，加热驱除乙醇。

    C、硬糖：蜜饯类，淀粉软糖：称取5.0或10.0克粉碎的样品，加30毫升水，温热溶解，若样液PH值较高，用20％柠檬酸溶液调至PH4左右。

    D、含蛋奶的样品

    (1)奶糖：称取10.0克粉碎均匀的样品，加30毫升乙醇-氨溶液溶解，置水浴上浓缩至约20毫升，立即用1：10硫酸调溶液至微酸隆再加1.0毫升1：l0硫酸，加1毫升l0％钨酸钠溶液，使蛋白质沉淀，过滤，用少量水洗涤，收集滤液。

    (2)蛋糕类：称取10.0克粉碎均匀的样品，加海砂少许，混匀、用热风风干样品(用手摸已干燥即可以)，加入30毫升石油醚搅拌，放置片刻，倾出石油醚，如此重复处理三次，以除去脂肪吹干后研细，全部转人G3垂融漏斗或普通漏斗中，用乙醇—氨溶液提取色素，直至色素全部提完以下按(1)自“置水浴下浓缩至约20毫升”起依法操作。

    2、吸附分离

    将处理后所得的溶液加热至70℃，加入0.5-1.0克聚酰胺粉充分搅拌，用20％柠檬酸溶液调PH至4，使色素完全被吸附，若溶液还有颜色，可以再加一些聚酰胺粉。将吸附色素的聚酰胺全部转入G3垂融漏斗或玻璃漏斗中过滤(如用G3垂融漏斗过滤，可以用水泵慢慢地抽滤)。用20％柠檬酸酸化PH＝4的70℃水反复洗涤，每次20毫升，边洗边搅拌，若含有天然色素再用甲醇-甲酸溶液洗涤1-3次，每次20毫升，至洗液无色为止。再用70℃水多次洗涤至流出的溶液为中性。洗涤过程中必须充分搅拌。然后用乙醇-氨溶液分次解吸全部色素，收集全部解吸液，于水浴上驱氨。如果为单色，则用水准确稀释至50毫升，用分光光度法进行测定。如果为多种色素混合液，则进行纸色谱或薄层色谱法分离后测定，即将上述溶液置水浴上浓缩至约2毫升后移人5毫升容量瓶中，用50％乙醇洗涤容器，洗液并入容量瓶中并稀释至刻度。

    3、定性

    A、纸色谱

    取色谱用纸，在距底边2cm的起始线上分别点3-10微升样品溶液，1-2微升色素标准溶液，挂于分别盛有a、b、c、d、e、f的展开剂的层析缸中，用上行法展开，待溶剂前沿展至15cm处，将滤纸取出于空气中晾干，与标准斑比较定性。

    也可取0.5毫升样液，在起始线上从左到右点成条状，纸的右边点色素标准溶液，依法展开，晾干后先定性后定量，靛蓝在碱性条件下易褪色可用e展开剂。

    B、薄层色谱

    (1)薄层板的制备

    称取1.6克聚胺粉，0.4克可溶性淀粉及2克硅胶G，置于合适的研钵中，加15毫升水研匀后，立即置涂布器中铺成厚度为0.3mm的板。在室温晾干后，于80℃干燥1小时置于燥器中备用。

(2)点样

    离板底边2cm处将0.5毫升样液从左到右点成与底边平行的条状的右边点2微升色素标准溶液。

    (3)展开

    苋菜红与胭脂红用d展开剂，靛蓝与亮蓝用e展开剂，柠檬黄与其他色素用f展开剂。取适量展开剂倒入展开槽中，将薄层板放入展开，待色素明显分开后取出，晾干，与标准斑比较，如比移值相同即为同一色素。

    4、定量

A样品测定   

将纸色谱的条状色斑剪下，用少量热水洗涤数次，洗液移入10毫升比色管中，并加水稀释至刻度，作比色法定用。   

    将薄层色谱的条状色斑包括有扩散的部分，分别用刮刀刮下，移入漏斗中，用乙醇-氨溶液解吸色素，少量反复多次至解吸液无色，收集解吸液于蒸发皿中，于水浴上挥发除去氨，移入10毫升比色管中，加水至刻度作比色用。

  B、标准曲线制备

分别吸取0.0、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0ml胭脂红，柠檬黄，日落黄色素标准使用液或0.0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0ml亮蓝，靛蓝色素标准溶液，分别置于10ml比色管中，各加水稀释至刻度。

上述样品与标准管分别用1cm比色杯，以零管调节零点，于一定波长下（胭脂红510nm，苋菜红520nm，柠檬黄430nm，日落黄482nm，亮蓝627nm），测定吸光度，分别绘制标准曲线比较或与标准色列目测比较。

计算：

 X=(A*100)/(m*V2/V1*1000)

式中：

X：样品中色素的含量，克/千克/升

A：测定用样液中色素的含量，毫克

:m：样品质量（体积），克（毫克）

V1：样品解吸后总体积，毫升

V1：样液点板（纸）体积，毫升