1、分子量的测定
根据凝胶色谱的原理，样品物质在凝胶色谱柱中的洗脱性质与该物质的分子大小有关。因此选用不同的凝胶色谱柱后，能方便地测定物质的分子量。用此法测定分子量时，可以在各种PH值、离子强度和温度条件下进行。所测定的物质可以是天然状态，也可以是变性后的。
实际应用中，可先选用一系列已知分子量的标准样品在同一色谱条件下进行色谱分离分析，并以保留体积（或保留时间）对分子量的对数作图，在一定分子量范围内得到一直线（标准曲线），而后根据待测定物在同一条件下的保留体积（或保留时间），从标准曲线上查得/计算出其分子量。

目前用本法测定分子量的应用范围非常广泛。
高分子物质的分子量及其分布的测定：特别是近年来，随着各种高分子材料的问世，人们对高分子科学的不断探索，高聚物的分子量及其分布的测定显得尤为重要，成为科研和生产中不可缺少的测试项目之一。例如：常见的聚苯乙烯塑料制品，其分子量为十几万，如果聚苯乙烯的分子量低至几千，就不能成型；相反，当分子量大到几百万，甚至几千万，它又难以加工，失去了实用意义。科研和生产上通过控制高聚物的分子量及其分布宽度指数D（D=Mw/Mn）、分子量微分分布曲线、分子量积分分布曲线来生产出性能最佳的高聚物产品。同样，除了快速测定分子量及其分布以外，凝胶渗透色谱还广泛被用于研究高聚物的支化度，共聚物的组成分布及高聚物中微量添加剂的分析等方面。如果配以在线的绝对分子量检测器（如：LALLS、Multi-Angle LS、Dual-Angle LS等），凝胶渗透色谱可以测定高聚物的绝对分子量。
蛋白质分子量的测定：现代蛋白质药物的研究中，凝胶色谱法测定分子量是蛋白质分子量的快速测定方法之一。一般选用标准分子量蛋白质（如：铁蛋白、醛缩酶、牛血清白蛋白、卵清蛋白、胃蛋白酶、核糖核酸酶，这就是一组分子量从300KD到14KD的标准品）。

2、分离多组分混合物
在一个多组分混合物中，因各组分的分子量的不同，可以用凝胶色谱法将其各组分分开。当被分离组分的分子量相距较大时，如进行蛋白质和氨基酸，核酸和核苷酸等分离时，选择大颗粒、高交联度的凝胶。而当分离物质的分子量差别较小，则选择一种胶粒能使被分离的组分均包括在该胶粒的分布范围内。
3、脱盐与分离纯化
特别是在生物大分子的分离纯化过程中，经常使用盐进行盐析或洗脱，其高浓度的盐会给下一步的纯化带来不便，因此需将其全部或大部分除去。透析法除盐不仅耗时较长，而且较烦琐。凝胶色谱脱盐就是一种简单又快速的方法。由于脱盐是将分子量相距很大的两类物质的分开，所以一般用于脱盐的凝胶多为大颗粒、高交联度的凝胶。此时，溶液中大分子（如蛋白质）的kd=0，盐类的kd=1，易于分离脱盐。实际中常用G-25进行脱盐，其效果不仅比透析法快的多，而且比较完全，并且回收率高。
4、去热源
热源是微生物产生的某些可以使人发热的物质，多为内毒素，是制药中必须去除的物质。内毒素是一个含脂肪A、糖类和蛋白，是带负电的复合大分子。内毒素经常是多聚体，凝胶过滤层析可有效地将之去除，特别是在小分子药物。选用的凝胶可以与脱盐类似，只是此时热源等大分子物质的kd=0，而小分子药物的kd=1，同样可以很好而且很方便地去除热源类物质。