微生食物中维生素B12的测定方法
微生物测定法
1.原理
维生素B12对于Lactobacillusleichmannii（ATCC7830）的正常生长是必需的，在一定生长条件下，Lactobacillusleichmannii的生长与繁殖速度和溶液中维生素B12的含量成一定的线性关系，利用浊度法或光密度法测定细菌生长和繁殖的强度可间接地测定食物样品中维生素B12的含量。本方法最低检出限0.001ng。
2.适用范围
本方法参考"Official Methods of Analysis of theAssociationof official AnalyticalChemists"、"MethodsofVitamin Analysis"以及"Methodsofthe Microbiological Analysis ofSelectedNutrients"。本方法适用于测定食物及饲料中的维生素B12含量。
3.试剂
本试验所用水均为蒸馏水，所用试剂均需分析纯试剂。
3.1 甲苯
3.2 柠檬酸（C6H8O7·3H2O）
3.3 磷酸氢二钠（Na2HPO4）
3.4 焦亚硫酸钠（Na2S2O5）
3.5 抗坏血酸（生化试剂）
3.6 无水葡萄糖
3.7 无水乙酸钠
3.8 L-胱氨酸（生化试剂）
3.9 D,L-色氨酸（生化试剂）
3.10 10mol/L氢氧化钠溶液：称取200g氢氧化钠溶于适量水中，定容至500ml。
3.11 （1+4） 乙醇溶液：200ml无水乙醇与800ml水充分混匀。
3.12 酸解酪蛋白：称取50g不含维生素的酪蛋白于500ml烧杯中，加200 ml3mol/L盐酸，121℃高压水解6小时。将水解物转移至蒸发皿内，在沸水浴上蒸发至膏状。加200ml水使之溶解后再蒸发至膏状，如此反复3次，以去除盐酸。以溴酚蓝作外指示剂，用10mol/L氢氧化钠调节pH至3.5。加20g活性炭，振摇，过滤，如果滤液不呈淡黄色或无色，可用活性炭重复处理。滤液加水稀释至500ml，加少许甲苯于冰箱中保存。（该试剂也可从Difco公司购得，产品号为No.0288-15-6。）
? 酸解的目的是为了消除酪蛋白中的维生素，确?；九嘌胁缓舛ǖ奈谺12，但有时酸水解不一定彻底，所以一定要选用不含维生素的酪蛋白粉（Sigma公司），这样可较好地确保酸解酪蛋白中不含维生素B12。
3.13 腺嘌呤、鸟嘌呤、尿嘧啶溶液：称取硫酸腺嘌呤（纯度为98%）、盐酸鸟嘌呤（生化试剂）以及尿嘧啶各0.1g于250ml烧杯中，加75ml水和2ml浓盐酸，然后加热使其完全溶解，冷却，若有沉淀产生，加盐酸数滴，再加热，如此反复，直至冷却后无沉淀产生为止，以水稀释至100ml。加少许甲苯于冰箱中保存。
3.14 维生素溶液Ⅰ：称取25mg核黄素，25mg盐酸硫胺素，0.25mg生物素，50mg尼克酸，用0.02mol/L乙酸溶液溶解并定容至1000ml。
3.15 维生素溶液Ⅱ：将50mg对氨基苯甲酸，25mg泛酸钙，100mg盐酸吡哆醇，100mg盐酸吡哆醛，20mg盐酸吡哆胺，5mg叶酸溶于（1+4）乙醇溶液，并定容至1000ml。
3.16 甲盐溶液：称取25gKH2PO4、25gK2HPO4溶于500ml水中，加5滴浓盐酸。
3.17 乙盐溶液： 称取10gMgSO47H2O、0.5gNaCl、0.5gMnSO44H2O，0.5gFeSO47H2O溶于水并定容至500ml，加5滴浓盐酸。
3.18 黄嘌呤溶液：称取1.0g黄嘌呤溶于200ml水中，70℃加热条件下，加入30mlNH4OH（2+3）L-天冬酰胺溶于水中，并定容至100ml。
3.19 吐温80溶液：将25g吐温-80溶于乙醇并定容至250ml。
3.20 维生素B12标准溶液（均使用棕色试剂瓶）
（1）3.20.1维生素B12标准储备溶液（100ng/ ml）：称取50μg（精度0.01mg天平）维生素B12暗红色针状结晶，用（1+4）的乙醇溶液定容至500ml，储存在2～4℃条件下。
（2）3.20.2维生素B12标准中间液（1ng/ml）：取1ml储备液用（1+4）的乙醇定容 至100ml.贮存于2～4℃条件下。
（3）3.20.3 维生素B12标准使用液（0.02ng/ ml）：取1ml中间液用水定容至50ml，用时现配。
? 维生素B12见光易分解，因此在配制标准液时要尽量避光，并且一定要使用棕色试剂瓶。
3.21 基本培养基：将下列试剂混合于500ml烧杯中，加水至200ml，以溴甲酚紫作外指 示剂，用10mol/L氢氧化钠液调节pH为6.0～6.1，用水稀释至250ml。
酸解酪蛋白25ml
腺嘌呤、鸟嘌呤、尿嘧啶溶液5ml
天冬胺酰溶液5ml
吐温-80溶液5ml
甲盐溶液5ml
乙盐溶液5ml
维生素溶液Ⅰ5ml
维生素溶液Ⅱ5ml
黄嘌呤溶液5ml
抗坏血酸1.0g
L-胱氨酸0.1g
D,L-色氨酸0.1g
无水葡萄糖10.0g
无水乙酸钠8.3g
该培养基也可从Difco公司购得，产品号为No.0457-15-1。
? 由于国内某些试剂纯度不够，所以自行配制的培养基较浑浊，严重影响到最后的浊度测定结果，因此建议最好使用进口培养基。
3.22 琼脂培养基：在600ml水中，加入15g蛋白胨，5g水溶性酵母提取物干粉，10g无水葡萄糖，2g无水磷酸二氢钾，100ml番茄汁，10ml吐温-80溶液，每500ml液体培养基加5.0~7.5g琼脂，加热溶解，用10mol/L氢氧化钠调节pH为6.5~6.8，然后定容至1000ml，分装于试管中，于121℃高压灭菌10分钟，取出后竖直试管，待冷却至室温后于冰箱保存。
3.23 生理盐水：称取9.0g氯化钠溶于1000ml水中，。每次使用时分别倒入2～4支试管中，每支约加10ml，塞好棉塞，于121℃高压灭菌10分钟，备用。
3.24 0.4g/L溴甲酚紫指示剂：称取0.1g溴甲酚紫于小研钵内，加1.6ml 0.1mol/L氢氧化钠研磨，加少许水继续研磨，直至完全溶解，用水稀释至250ml。
4.仪器与设备
4.1 实验室常用设备
4.2 电热恒温培养箱
4.3 压力蒸汽消毒器
4.4 液体快速混合器
4.5 离心机
4.6 硬质玻璃试管：20mm×150mm
5.菌种与培养液的制备与保存
5.1 储备菌种的制备：Lactobacillusleichmannii（ATCC7830）接种于直面琼脂培养管中，在37±0.5℃恒温箱中培养16~24小时，取出后放入冰箱中保存。每周至少传种二次以上。在实验前一天必须传种一次。
?Lactobacillusleichmannii （ATCC7830）的生命力不强，每周一定要至少传代2-3次，否则极易死亡!
5.2 种子培养液的制备：加2ml 0.02ng/ml维生素B12标准工作液和3ml基本培养基于10ml离心管中，塞好棉塞，于121℃高压灭菌10分钟，取出冷却后于冰箱中保存。每次制备两管，备用。
? 加入离心管中的维生素B12标准工作液要适量，过少会阻碍Lactobacillus Leichmanni的生长，过多会使零管中的光密度值增大，影响测定结果的准确性。一般2-3ml即可。
6. 操作步骤
6.1 接种液的配制：使用前一天，将已在琼脂管中生长16~24小时的L.leichmannii 接种于种子培养液中，在37±0.5℃培养16~24小时，取出后离心10分钟（3000rpm），弃去上清液，用已灭菌的生理盐水淋洗2次，再加入3ml灭菌生理盐水，混匀后，将此液倒入已灭菌的注射器中，立即使用。
6.2 水解液的制备：称取1.3g无水磷酸二氢钠、1.2g柠檬酸及0.1g焦亚硫酸钠（Na2S2O5），溶于水中并定容至100ml，用时现配。
6.3 称取适量样品，至于100ml三角瓶中，加70ml水解液，混匀，于121℃高压灭菌10分钟，取出冷却至室温，过滤，然后以溴甲酚紫为外指示剂，用10mol/L氢氧化钠溶液调节pH为6.0~6.1，将水解液移至100ml容量瓶中，定容至刻度。为保证最后样品测定管中的Na2S2O5的浓度≤0.03mg/ml，因此要做适当的稀释。
? 测定管中Na2S2O5的浓度一定要小于0.03mg/ml，过多会抑制L.Leichmannii的生长，因此在称取样品时要考虑到后来的稀释倍数，避免由于稀释倍数过大造成测定管中的维生素B12含量过低，无法检出。
? 实验所用的所有试管必须在烤箱中180-200℃条件下干热灭菌2-3小时。
6.4 样品试管的制备：每组平行样品管中分别加入1.0、2.0、3.0、4.0ml样品水解液，并用水稀释至5ml，然后再加入5ml基本液体培养基。
6.5 标准系列管的制备：每组试管中分别加入维生素B12标准工作液0.0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0ml，使每组试管中维生素B12的含量为0.00ng、0.02ng、0.04ng、0.06ng、0.08ng、0.1ng，加水至5ml，再加入5ml基本液体培养基，需做三组标准曲线。
6.6 灭菌：样品管与标准管均用棉塞塞好，于121℃高压灭菌10分钟。
? 灭菌时间不宜过长，否则会破坏基本培养基中的营养成分，影响Lactobacillus Leichmannii的生长，最好在5-10分钟内。
6.7 接种与培养：待试管冷至室温后，每管接一滴种子菌液，于37±0.5℃恒温箱中培养16~20小时。
? （1）接种前，接种室要在紫外灯下消毒至少30分钟。（2）在接种时，其中一支标准系列0管可不接种，这样可观察此次实验是否存在污染，并且可消除由于管中液体的颜色造成的误差。
6.8 测定光密度值：于640nm波长条件下，以标准系列中零管调节仪器零点，测定样品管液体及标准管液体的光密度值。
? 首先以未接种的标准系列0管进行仪器调零，然后在用接种后的标准系列0管进行二次调零，之后再测定其他管中液体的光密度值。
7.结果计算
以维生素B12标准系列的不同纳克数为横坐标，光密度值为纵坐标，绘制标准曲线。由样品测定管中的光密度值在曲线上查出相对应的样品测定管中的维生素B12含量，再按以下公式计算样品中维生素B12含量：
     c·V·f
X= --------------×100
      m×1000
式中：
X──样品中维生素B12含量，μg/100g：
c──测定管中的维生素B12含量，ng：
V──样品水解液的定容体积，ml：
f──样品液的稀释倍数
m──样品质量，g。
100/1000 ── 单位换算系数
8.注意事项
（1） 全部实验操作应注意避免日光直接照射。
（2） 在人体肠道中，大肠杆菌可以合成维生素B12，因此，此实验极易被污染，在整个实验中，最重要的是注意清洁问题，确保所用的玻璃器皿、操作环境要清洁。