维生素A和维生素E的测定方法（HPLC） 
 1.原理
食物中的维生素A及维生素E经皂化提取以后，将其不可皂化的部分提取到有机溶剂中。用HPLC法测定维生素A及维生素E的含量。

2.适用范围
GB12388-90 本法适用于各种食物和饲料的测定
3. 仪器
（1） 高压液相色谱仪（带紫外检测器）
（2） 六孔恒温水浴锅
（3） 旋转蒸发器
（4） 高纯氮气
（5） 高速离心机
4. 试剂
本实验所用试剂皆为分析纯，所用水皆为蒸馏水
4.1无水乙醇：重蒸，不含有醛类物质
检查方法：取2ml银氨溶液于试管中，加入少量乙醇，摇匀，再加入10%氢氧化钠溶液，加热，放置冷却后，若有银镜反应则表示乙醇中有醛。
脱醛方法：取2g硝酸银溶于少量水中。取4g氢氧化钠溶于温乙醇中。将两者倾入1L乙醇中，振摇后，放置暗处两天（不时摇动，促进反应），经过滤，置蒸馏瓶蒸馏，弃去初蒸出的50ml。当乙醇中：
4.2 10%抗坏血酸溶液（Vc） W/V 临用前配制
4.3 50%氢氧化钾溶液（KOH） W/V
4.4 无水乙醚 重蒸，不含过氧化物
4.4.1过氧化物检查方法：用5ml乙醚加1ml10%碘化钾溶液，振摇1min，如有过氧化物则放出游离碘，水层呈黄色或加4滴0.5%淀粉液，水层呈蓝色。该乙醚需处理后使用。
4.4.2 去除过氧化物的方法：重蒸乙醚时，瓶中放入铁丝或铁末少许。弃去10%初馏液和10%残馏液。
4.5 pH 1-14试纸
4.6 无水硫酸钠 Na2SO4
4.7 甲醇 色谱纯或分析纯重蒸后使用
4.8 重蒸水 蒸馏水中加入少量高锰酸钾重蒸后使用
4.9 苯并〔e〕芘标准液 称取苯并〔e〕芘（纯度98%），用脱醛乙醇配制成1ml相当于5μg苯并〔e〕芘的内标溶液。
4.10维生素A标准液 视黄醇（纯度85%Sigma公司）用脱醛乙醇溶解维生素A标准品，使其浓度大约为1ml相当于1mg视黄醇。临用前用紫外分光光度法标定其准确浓度。维生素E标准液α-生育酚（纯度95% Sigma公司），δ-生育酚（纯度95% Sigma公司），δ-生育酚（纯度95%Sigma公司）。用脱醛乙醇分别溶解以上三种维生素E标准品，使其浓度大约为1ml相当于1mg。临用前用紫外分光光度法分别标定此三种维生素E的准确浓度。

5.操作步骤
本实验需避光操作
样品皂化 称取样品于三角瓶中，加30ml无水乙醇，振摇三角瓶，使样品分散均匀。加入5ml10%抗坏血酸和苯并〔e〕芘标准液2ml，混匀。最后加入10ml氢氧化钾边加边振摇。于沸水浴上回流30min使样品皂化完全。皂化后立即放入冰水中冷却。
样品萃取将皂化后的样品移入分液漏斗中，用50ml水分2次洗皂化瓶，洗液并入分液漏斗中。用100ml无水乙醚分两次洗皂化瓶及残渣，乙醚液并入分液漏斗中。轻轻振摇分液漏斗2min，静置分层，弃去水层。然后每次用约100ml水将乙醚液洗至中性，约4-5次。
浓缩 将乙醚提取液经无水硫酸钠（约5g）滤入150ml旋转蒸发瓶内，用约15ml乙醚冲洗分液漏斗及无水硫酸钠2次，并入蒸发瓶内，并将其接在旋转蒸发器上，于55℃水浴中减压蒸馏并回收乙醚，待瓶中乙醚剩下约2ml时，取下蒸发瓶，立即用氮气将乙醚吹干。加入2ml乙醇溶液，充分混合，溶解提取物。将乙醇液移入塑料离心管中，于离心机上以3000转/min离心5分钟。上清液供色谱分析。
标准曲线的制备将维生素A和维生素E标准品配置成标准溶液（约1mg/ml），制备标准曲线前用紫外分光光度法标定其准确浓度。标准浓度的标定方法取维生素A和维生素E标准液若干微升，分别稀释至10.00ml乙醇中，并分别按给定波长测定各维生素的吸光值。用比吸光系数计算该维生素的浓度。测定条件如下  标     准
 比吸光系数E1%cm
 波    长 λ，nm
 
  视黄醇
      1835
      325
 
 α—生育酚
       71
      294
 
 γ—生育酚
       92.8
      298
 
 δ—生育酚
       91.2
      298
 

浓度计算：
X1= A/E×1/100×10.00/S×10-3
式中 X1：某维生素浓度，mg/ml；
A：维生素的平均紫外吸光值；
S：加入标准的量，μl；
E：某种维生素1%比吸光系数；
10.00/S×10-3 ：标准液稀释倍数。
本法采用内标两点法进行定量。把一定量的维生素A、维生素E及内标苯并〔e〕芘液混合均匀，选择合适的灵敏度，使上述物质的各峰高约为满量程的70%，作为高浓度点，高浓度的1/2为低浓度点（内标苯并〔e〕芘的浓度值不变），用此二种浓度的混合标准进行色谱分析。根据微处理机装置，按说明用二点内标法进行定量。
液相色谱分析
仪器所需条件
预柱：ODS 10μm，4mm×4.5cm。
分析柱：ODS 5μm，4.6mm×25cm。
流动相：甲醇：水=98：2。混匀，临用前脱气。
紫外检测器波长：300nm。量程0.02。
进样量：20μl进样定量环。
流速：1.65-1.70ml/min。

6.计算
X=C/m×V×100/1000
X：某种维生素的含量，mg/100g；
C：由标准曲线上查到某种维生素含量，μg/ml；
V：样品浓缩定容体积，ml；
m：样品质量，g；
用微处理机二点内标法进行计算时，按计算公式计算或由微机直
接给出结果。

7.注意事项
（1） 维生素A极易被破坏，实验操作应在微弱光线下进行，或用棕色玻璃仪器。
（2） 在皂化过程中，应每5分钟摇一下皂化瓶，使样品皂化完全。
（3） 提取过程中，振摇不应太剧烈，避免溶液乳化而不易分层。
（4） 洗涤时，最初水洗轻摇，逐次振摇强度可增加。
（5） 无水硫酸钠如有结块，应烘干后使用。
（6） 在旋转蒸发时，乙醚溶液不应蒸干，以免被测样品含量有损失。
（7） 用高纯氮吹干时，氮气不能开的太大，避免样品吹出瓶外结果偏低。